細菌基因組完成圖真菌基因組完成圖微生物群落多樣性宏基因組測序服務全長轉錄組測序第三代測序服務非靶向代謝組學靶向代謝組學脂質組學離子組學脂肪酸檢測氨基酸檢測代謝組學服務定量蛋白質組服務雙向電泳服務修飾蛋白質組蛋白質芯片蛋白質譜鑒定蛋白互作檢測Western Blot蛋白質組學服務高通量測序數據分析蛋白質組學數據分析代謝組學數據分析芯片數據分析GO/Pathway富集分析相關性和聚類分析共表達網絡圖靶基因預測調控網絡圖蛋白相互作用網絡圖生物信息學服務CRISPR/Cas9載體構建穩定細胞系構建服務模式生物制備服務CRISPR/Cas9技術服務甲基化測序服務甲基化芯片服務甲基化驗證服務DNA甲基化服務lncRNA測序服務lncRNA芯片服務lncRNA定量PCR驗證lncRNA過表達服務lncRNA抑制服務lncRNA技術服務miRNA測序服務miRNA芯片服務miRNA定量PCR驗證miRNA過表達服務miRNA抑制服務miRNA靶基因驗證服務miRNA技術服務環狀RNA測序服務環狀RNA芯片服務環狀RNA定量PCR驗證環狀RNA過表達服務環狀RNA抑制服務環狀RNA技術服務轉錄組測序服務表達譜測序服務mRNA/lncRNA/環狀RNA 三合一芯片表達譜芯片服務熒光定量PCR驗證mRNA過表達服務mRNA抑制服務mRNA技術服務轉錄因子篩選服務抗體制備服務ChiP-Seq測序服務ChiP-qPCR技術服務EMSA技術服務luciferase 實驗服務轉錄因子技術服務mRNA定量PCR檢測miRNA定量PCR檢測lncRNA定量PCR檢測環狀RNA定量PCR檢測DNA拷貝數檢測相對定量PCR服務絕對定量PCR服務熒光定量PCR服務整體課題服務SNP分型檢測服務SSR/STR技術服務病毒包裝服務CRISPR/Cas9技術試劑miRNA功能研究試劑lncRNA功能研究試劑環狀RNA功能研究試劑mRNA功能研究試劑發表文獻樣品準備服務流程基金申請
穩定細胞系構建服務
服務詳情

簡介

     CRISPR/ Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是最近幾年興起用于靶向基因特定DNA修飾的重要工具。CRISPR是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機制。細菌在CRISPR和Cas9的幫助下,可以經由小RNA分子的引導,靶標和沉默入侵者遺傳信息的關鍵部分。在該系統中,crRNA(CRISPR-derived RNA)與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成的復合物能特異性識別靶基因序列,并引導Cas9核酸內切酶在靶定位點剪切雙鏈DNA,隨后,細胞的非同源末端連接修復機制(NHEJ)重新連接斷裂處的基因組DNA,并引入插入或缺失突變。我們也可以提供一個外源雙鏈供體DNA片段(Donor)通過同源重組(HR)整合進斷裂處的基因組。從而達到對基因組DNA進行修飾的目的。目前,CRISPR/Cas9系統的高效基因組編輯功能已被應用于多種模式生物,包括人、小鼠、大鼠、斑馬魚、秀麗隱桿線蟲、植物及細菌。

  客戶只需提供物種、基因名稱和靶細胞,言行生物提供整套的CRISPR/Cas9基因編輯的穩定細胞系構建服務和結果報告。

服務流程

一、預實驗

1.  Cas9導入細胞方法:嘗試各種方法,如脂質體類轉染、電轉、慢病毒感染、腺病毒感染等,確定高效導入Cas9方法。

2.   藥物濃度預實驗:降低后續陽性克隆篩選和檢測工作難度。

3.  單克隆培養情況:觀察細胞是否可以單克隆培養。

二、基因敲除(敲入)

1.    靶點設計

一般在不同轉錄產物的共同外顯子上設計3個靶點,靶點位置盡量在基因CDS的前1/3,ATG之后,最好能破壞重要的domain和所有的轉錄產物isoform。第一批合成構建3個,效果不佳或時間緊張的可一次構建6個。

2.   載體構建和病毒包裝

根據預實驗結果,選擇合適的普通載體或病毒載體,言行生物現擁有3類載體:普通Cas9載體、慢病毒Cas9載體和腺病毒Cas9載體。

3.   內源活性篩選

轉染細胞或感染細胞48H后,使用PuroBlasticidin篩選48H,提取基因組DNA。使用T7E1酶驗證打靶載體的活性。將有效的突變型PCR產物測序驗證。

4.   Donor載體(基因敲入)

根據篩選的gRNA靶點位置,構建Donor普通載體或腺病毒載體。共轉染/感染 Cas9-gRNADonor。

5.   單克隆篩選

無限稀釋到每孔1個細胞的數量,每株細胞鋪至少296孔板。細胞長好夠,驗證內源活性并送測。

6.   獲得突變型

如需純合子,則可能需要重復步驟3-5。


成功實例

293T細胞基因點突變



      

參考文獻

1、RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9 .Science. 2013 Feb 15 339(6121):823-6.

2、Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 2013 Feb 15 339(6121):819-23.